行研 | 与传染病共存,未来家用分子检测路在何方?

前言

21世纪以来,多种传染病频发,从03年的非典型肺炎、各种不同亚型的流感、非洲的埃博拉病毒、到肆虐全球的新冠肺炎,无一不是影响巨大,过去、现在、将来都时刻挑战着人类的公共卫生体系。随着科学技术的进步,以qPCR技术为主的分子诊断也得到长足的发展,分子诊断已经成为了体外诊断中增速最快的行业。


一、新冠疫情带动诊断行业的高速发展,检测方式趋向于自动化、快速化

21世纪以来,传染病间断性爆发,伴随着全球一体化,导致疾病防控面临极大压力。2019年全球新冠疫情爆发,带来了整个分子检测行业的新变化:一是诊疗体系从传统的以医院为中心变为去中心化;二是检测场景从医院检测变成社区或家用检测;三是对检测技术提出更高的要求,规模化、自动化、快速化成为趋势。

1. 检验自动化设备或实验室自动化发展迅速

为了应对大量的检测需求,各种检测方法、检测设备也是应时而生。从检测方法来说,除qPCR作为COVID的检测金标准外,抗原检测、等温扩增检测、CRISPR检测等检测方法也通过快速研发用于检测;从检测设备而言,实验室自动化、检测自动化等行业发展如火如荼,如Roche的核酸检测一体机Cobas 6800已经成为PCR一体机的标杆,售价约500万元;虽然成本增加,但极大地降低了污染的风险跟对人员的要求。当然,由于全自动一体机设备成本较高,不少机构都是采取自动的核酸提取仪+实时荧光定量PCR分析仪的检测方式来降低人力成本,提高检测效率。

Cobas 6800一体机

2. 检验方法:抗原检测、等温扩增检测等产品大量获批

qPCR是核酸检测最常见的使用方法,也是检验的金标准。然而国内大范围的筛查,导致样本量非常大,对于检测时间要求也比较高。抗原检测、等温扩增检测等产品也被大量研发并被应用于市场。以抗原检测为例,截至2022年4月,国内NMPA共批准了23款抗原检测产品,且对比抗原检测的结果,与国外的抗原检测产品能够达到一致的检验性能。在2022年上海本次疫情中,大量的抗原检测试剂盒被用于核酸检测前的自我筛查。根据销售情况,抗原检测试剂盒在海外市场占据大量规模,2021年我国的新冠抗原检测试剂盒海外销售规模超700亿元。

等温扩增检测技术也是在新冠疫情之后得到极大的发展。从FDA、CE等获批情况来看,2021年美国批准了3款家用分子检测的产品,主要都是采取等温扩增检测技术,可在30分钟-1个小时内得到检验结果。国内也有如优思达、普世利华、热景生物等公司的分子POCT产品获得CE认证,并开始销售。

CRISPR检测技术近两年来也在新冠领域异军突起,具备底层技术的Proof diagnostics 2022年4月已经完成基于CRISPR检测技术的新冠核酸检测产品研发并提交FDA的EUA申请审批,有望在今年3季度获得批准并正式应用。

二、家用检测成为未来的检测趋势

1. 传统居家检测领域及发展局限性

在新冠疫情以前,家用检测整体发展都不太充分。传统的家用检测主要都聚焦在肿瘤筛查、慢性病监测、性传播疾病筛查等领域。比如结直肠癌的筛查,用户自采样后将样本直接寄回,第三方医学检验中心采取测序等技术对样本进行检测后将结果直接反馈给用户,这种方式主要针对肿瘤筛查、HPV病毒检测等;慢性病监测领域如糖尿病患者等采取居家血糖检测;性传播疾病筛查如HIV、梅毒的筛查,由于这类疾病隐私性比较强,因此在国内也具备一定的发展规模,据悉HIV检测试剂盒在网上1小时至少卖出500盒。家用市场亟需准确性高、检测效率高的检测方式。

2. 新冠疫情后家用分子检测进入新阶段

很多国家迟迟不敢放松对居家自检产品的限制,检测数据的管理便是一个重要原因。特别是像新冠这种具有高传染性的疾病,当消费者自行检测出阳性而瞒报结果时,后续可能会衍生出的一系列问题。新冠的爆发导致大规模的采样、人群聚集,同时国内采样人员极度稀缺,采样员也成为了一个工种,无疑加深了大家对家庭自检产品的理解,也加快了部分国家的居家检测趋势。2020年底,国家药监局发布《家用体外诊断医疗器械注册技术审查指导原则》,也意味着家用体外诊断进入一个新阶段。

在发达国家如美国的家用分子检测也得到快速的发展。根据美国2021年获批的家用OTC的新冠检测产品以及美国全国的检测量,可以发现2021年抗原检测占比达到所有检测占比的15%,家用新冠分子检测试剂盒销售超1000万件,占所有新冠检测的5%。

2021年,FDA获批了三种家用分子检测试剂盒。其中以Cue health、Lucira health最为突出。2020年11月,Lucira health产品获批,2021年3月,Cue的新冠检测产品获批。两者均主要采取等温扩增的检测方式进行。当然这两款居家自检产品,在产品设计上存在差异。Cue Health采取的一个可重复使用的卡盒阅读器(Cue Cartridge Reader),可与智能手机App通讯并运行检测卡,另一部分是一次性使用组件,一次性组件价格约60美元左右。可通过与智能手机连接后,全程由手机App提示操作并显示结果,便于数据统计管理。Cue health以一个新冠检测单产品实现2021年收入达到6.18亿美元,2022年Q1已经实现收入1.8亿美元。而Lucira Health只是一个一次性使用测试套件,目前售价大约75美元左右。

3. 国内居家分子检测发展情况

国内也有一家上市公司Prenetics在疫情期间引入牛津大学的技术从而研发出新冠的家用分子检测产品。主要为Circle HealthPod检测系统(售价约990港币)+一次性检测组件(售价约200港币),已获得CE认证,截至2022年Q1,实现超2200万件组件销售。该检测系统采取逆转录、环介导等温扩增LAMP技术进行检测,可在20分钟内提供结果。根据Prenetics的数据显示,可以实现96%的灵敏度和99.9%的特异性,跟qPCR检测的符合率达到98.4%。

除Prenetics外,国内还有多家企业在2021年左右研发出基于不同的等温扩增技术用于家庭新冠自检的产品。包括优思达、普世利华、先达基因等。这三家公司的扩增技术均不相同,分别采用CPA、RHAM以及New ERA的等温扩增技术。优思达的产品已经在2022年4月获得CE的自测认证。

优思达主要研发的是基于等温扩增技术(交叉引物恒温扩增技术,CPA)的新冠自测产品。2021年4月拿到专业使用场景的CE认证, 2022年4月获得CE的自测认证。普世利华通过自主RHAM等温扩增技术,进行等温放大和信号释放,扩增性能与qPCR相当,远优于传统的LAMP扩增技术。先达基因研发出新一代等温扩增(New ERA)技术,在恒定温度条件下,5-8分钟即可将DNA/RNA扩增数亿倍,配合独特的引物与探针自环化结构,使全程检测仅需10分钟左右即可完成。

4. 家用型的PCR检测仪

除了上述的等温分子检测仪器与试剂盒外,海外也出现了很多的小型多重PCR仪器以期用于家庭自检,如Visby medical 2022年获得了E轮超1.35亿万美元的融资,目标是提供世界上第一个无仪器手持式PCR平台,2021年2月获得了FDA的一次性RT-PCR COVID-19床旁测试的紧急使用授权。它还获得了FDA 510(k)许可和CLIA豁免,用于一次性多重检测沙眼衣原体,淋病奈瑟菌和阴道毛滴虫。Filmarry创始人也开始进军PCR家庭自检,Idaho Molecular和Advanced concepts在过去的1年时间里,研发了“Eikon”的PCR平台结合新型冠状病毒感染症(COVID-19)检测。目前已经开始临床试验,并向美国FDA提交紧急使用授权。

基于试剂盒的Eikon仪器可对多达6个目标进行多重qPCR,通过云连接软件解读荧光读数。可以在30分钟内提供诊断结果,预计成本在300美元左右,测试盒的价格约为15至20美元。

5. qPCR和恒温扩增仍存在一定局限性

(1)qPCR虽为核酸检测的金标准,但存在诸多限制

qPCR目前仍然是核酸检测的金标准,也是最常采用的检测方法。由于其技术发展时间较长,成熟度较高,qPCR检测成本也逐步降低,大众接受程度也高。但是qPCR检测也存在一定限制:

A. 大规模人群采样导致感染风险:既往均通过大规模人群集中采样的方式开展qPCR检测,且采取10混1或者5混1的方式进行采集,能够降低成本,但是对于医护人员而言可能会接触大量的潜在感染者,采样后也多由第三方检验机构进行检测。而在医院门急诊等小规模采样检测场景下,qPCR检测不具备成本优势。

B. 样本运输、核酸提取纯化等耗时长:qPCR检测技术在自动化的发展下,检测时间也逐步缩短,可在2小时内出具结果,但由于大量样本为第三方实验室检测,涉及到的样本运输、保存、核酸提取纯化等时间成本及人力成本相对较高。

C. 气溶胶风险及高场地要求:为达到其灵敏度跟特异性,变温扩增过程无可避免,扩增过程中会导致病原片段大量复制,从而可能会导致气溶胶、样本交叉污染的风险。因此对于检测场地要求较高,所以qPCR无法适用于床旁的快速检测等。

D. 检测设备要求高:qPCR由于其扩增的过程涉及变温、退火等环节,因此对设备要求较高,而无法像等温扩增或者免扩增的CRISPR技术一样对设备要求较低。

 

(2)等温扩增能够实现快速、现场检测,但是假阳性率较高

近两年来发展迅速的等温扩增检测技术可以实现样本现场采集后直接现场测量,且由于扩增效率高,检验结果可在30min内获得。但是等温扩增检测技术受限于扩增过程中会出现大量的非特异性扩增,从而导致大量的假阳性产生,检测特异性较低。同时由于是等温扩增,对于引物设计要求也较高。

当然,也正是由于其等温扩增,降低了对检测设备的要求,所以2021年国内外大量产品研发出来被应用于家用新冠检测,但不可否认的是大流行下假阳性的结果势必会产生一些其他的影响。

三、CRISPR是家用分子检测以及床旁(急诊/社区)快速检测的最佳解决方案

2021年家用分子检测发展非常迅速,但是仍以等温扩增技术为主,存在一定的局限性。而随着CRISPR诊断技术的逐步发展与成熟,同时具备相应的优势,大家也在逐步将CRISPR诊断技术应用于家用分子检测。

1. CRISPR检测原理

2016年,国外两个团队发现了CRISPR的新酶,可以进行非特异性的切割,CRISPR检测技术便由此展开。CRISPR检测技术所用的Cas蛋白主要有Cas12、Cas13,这类蛋白除了与Cas9一样,具有特异性切割靶序列的功能外,在激活状态下,还具有非特异性切割其它核酸序列的功能。在没有激活的状态下,Cas蛋白保持沉默;一旦被激活,便会进行非特异性切割其他携带荧光信号的核酸序列,从而可以释放荧光信号,从而用来进行检测。

Cas12在crRNA引导下即可识别靶标dsDNA,并靶向富含T的PAM位点,对靶序列进行特异性切割,同时附带非特异性切割ssDNA的活性。靶标核酸经等温(RPA或LAMP)扩增富集,然后扩增产物与Cas12-crRNA结合,激活Cas12的附属切割功能,对ssDNA荧光探针进行切割,释放荧光基团,形成检测信号。

Cas13是一种RNA引导的RNA核酸内切酶,可在crRNA的引导下特异性切割单链靶标RNA,并在完成切割后,可继续保持活性并切割其他非靶标RNA。靶标核酸经等温扩增技术RPA扩增并引入T7启动子序列后,再利用T7 RNA聚合酶转录形成ssRNA,转录产物与Cas13a-crRNA结合,激活Cas13a核酸酶活性,切割ssRNA荧光探针,释放可被检测的荧光基团。

国外最早于2016年发现的酶是Cas13 跟 Cas12a的酶,并在2018年发表基于Cas13 跟 Cas12a的酶的检测技术;国内在2018年也在Cell Discovery期刊上发表了两篇文章,分别是中国科学院上海生命科学研究院王金团队开发的基于Cas12a的分子诊断技术及中国科学院李伟教授团队发现的基于Cas12b 酶的工程化应用。

2022年,Nature发布年度值得关注的技术榜单,其中CRISPR-Cas诊断检测被列为其中之一,通过Cas12酶或者Cas13酶的特征,可检测广泛的病原体,乃至有效地诊断其他非感染性疾病。目前国内外的公司借助CRISPR检测技术已经可以在30分钟内实现针对病原的快速、准确的检测。

2. CRISPR检测未来技术趋势

从2018年以来,CRISPR检测技术的文献研究愈发增多,到2021年已超上千篇。CRISPR检测技术也愈发成熟,并不断拓展。目前来看,检测技术主要向3个方向拓展研发。

CRISPR/Cas系统作为一种可特异性识别靶序列,并具有催化放大信号功能的检测技术,在Cas12以及Cas13酶对反应体系中其他的荧光探针剪切后短时间就能放大到10^5的荧光信号出来,可直接对靶标序列进行检测,但目前的检测方法,均需预先扩增靶标核酸后,其检测灵敏‍度方可满足诊断要求,这就增加了操作步骤,耗时也更长。

CRISPR检测技术天然具备免扩增的基础。未来通过免扩增可降低检测设备的要求,同时也可以直接从源头上避免气溶胶污染的风险。目前免扩增的技术主要通过酶促级联放大(使用多种核酸酶,在Cas12b激活后进行进一步的酶学放大,提高核酸探针的切割效率,如国外已经有研究在Cas13激活后使用另一种称为 Csm6的 Cas 蛋白来放大荧光信号)、电化学传感放大(石墨烯场效应晶体管)、微容量CRISPR-Dx系统(微流控、微液滴技术等)来实现。

通过微流控等方式实现dd CRISPR定量检测,进而在未来具备更广阔的发展空间。

可以用单个Cas蛋白检测一种病原体,也可同时使用几种酶进行多重分析,以区分多种病原体,在未来临床或家用时实现多联检测,更便捷、更适用、成本更低。如张锋团队在SHERLOCKv2系统中增加了Cas蛋白的种类(LwaCas13a 、PsmCas13b、CcaCas13b 和AsCas12a),这样可以同时检测到四种病毒;并利用Csm6酶放大其检测信号。

3. CRISPR具备差异化竞争优势,是家用分子检测以及床旁(急诊/社区)快速检测的最佳解决方案

对比qPCR及等温扩增检测技术而言,CRISPR检测技术采取等温扩增+Cas酶的反式切割,借助sgRNA的特异性识别,提升了等温扩增后的特异性,但又很好的保留了等温扩增的优势,比如可以实现现场快速检测、灵敏度高、检测设备要求低、单次检测成本低等,同时灵敏度可与qPCR相媲美,综合检测成本也低于qPCR。在未来,CRISPR检测技术实现免扩增后将避免气溶胶产生,进一步降低设备要求和环境要求,从而更适用于门、急诊、社区检测、海关检疫、家用等场景。

四、国内外CRISPR检测公司情况

目前国内外多家公司在开展基于CRISPR诊断的相关研发及产品设计,主要分为两大类。一大类是具备CRISPR底层专利酶(Cas12 、Cas13酶)技术并开展相关诊断的公司,如Proof diagnostics、迅识生物等。另一大类是借助CRISPR诊断技术开发相关设备的公司,但可能缺乏相关的底层酶专利,如杭州众测、杰毅生物等。

第一类具备底层酶和检测专利技术的公司,持续在优化技术和开发创新产品,报证的进展相较于单纯使用CRISPR技术研发设备、试剂盒的公司反而较慢,如国外进展最快的为Proof diagnostics,2022年4月将新冠的试剂盒提交FDA申请EUA,预计三季度可能会审批通过从而进行试用。国内具备底层Cas酶专利的两家公司迅识生物以及南京吐露港生物进展较快,吐露港生物已经于2021年9月与伯杰生物合作研发出新冠试剂盒并获批。

第二类聚焦在使用CRISPR技术开发诊断设备及耗材的公司进展相对较快,如杭州众测已经在2020年获得NMPA批准,研发的核酸检测试剂盒(国械注准20203400919)采用 RAA 技术扩增后,再使用 CRISPR 酶进行检测,通过简单三步即可在1个小时的时间里完成检测,是国内首次批准利用 CRISPR 技术的新冠病毒检测试剂盒,但存在一定风险。

国内外具备底层Cas酶专利且进展较快的公司主要为以下5家。国外的三家公司来源于两个实验室专利技术,且近两年来三家公司融资总额达到5亿美元,表明了资本市场对于CRISPR诊断的重视。且三家公司在获得融资之后都在往家用分子检测市场进行开拓。

1. Sherlock Biosciences

公司成立于2019年,由张锋参与成立,核心技术由麻省理工学院和哈佛大学授权。SHERLOCK技术是基于CRISPR/Cas13来检测,目前已升级到2.0版本——STOPCovid.V2。在样本制备的过程中通过加入磁珠富集样本中的RNA,从而提高起始RNA数量,进一步提高了 STOPCovid.V2 的检测灵敏度,能够达到93.1%的灵敏度、98.5%的特异性,且阳性样本只需15-45分钟就能获得结果。除此以外,SHERLOCK已被证明能检测寨卡病毒和登革热病毒,并能检测非小细胞肺癌患者液体活检中的不同突变。公司截至目前获得1.4亿美元的融资总额。

2. Proof Diagnostics

公司成立于2020年,主要基于CRISPR/Cas12b 酶进行诊断应用。通过18个月的研发,设计出了一种小型便携式智能设备可用于新冠检测,同时可以与手机进行绑定获得测试结果。目前Proof Diagnostics 已向美国FDA提交了一份申请,寻求其POCT Covid-19 测试 Proof Lab 系统的EUA。若获批,有望开启快速POCT和家庭分子自检的未来。

3. Mammoth Bioscience

2017年由Jennifer Doudna创立,主要利用CRISPR技术研发传染病、肿瘤学和基因突变方面的快速诊断。公司基于CRISPR-Cas12a的DETECTR系统能够分析细胞、血液、唾液、尿液和粪便,以检测基因突变、癌症和抗生素耐药性,以及诊断细菌和病毒感染。曾有研究利用DETECTR对包含人乳头瘤病毒(HPV)的患者样本进行测试,可以发现能够在感染多种不同HPV类型的样本中准确测定出高风险的HPV 类型:HPV16和HPV18。在新冠检测方面,基于CRISPR-Cas12的侧向流动测定法表明CRISPR-Cas12具有与qRT-PCR测试相同的敏感性和特异性,具有95%的阳性预测一致性和100%的阴性预测一致性。公司截至目前已经获得2.6亿美元的融资总额。

4. 迅识生物

公司成立于2020年,团队深耕分子诊断十余年,以CRISPR技术为核心,结合微流控技术和合成生物学,专注于新兴分子生物学技术的原创开发以及即时诊断( Point of Care Test, POCT )领域产品的研发和应用。公司拥有CRISPR/Cas检测技术授权,并已经实现相关成果转化及产业化。

5. 南京吐露港生物

吐露港生物的技术来源于中科院王金博士团队,公司在2017年开发了基于CRISPR/Cas12系统的创新核酸检测技术。2021年跟伯杰生物合作研发出伯杰BG-Nova-X8系统。搭配一同获批的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒能够在30min内完成多达24个样本的检测。


结语

迄今为止,基于CRISPR的诊断方法的出版物大多局限于传染病的检测。但由于CRISPR诊断特异性极好,可以检测到一个碱基的突变,或许未来在遗传性疾病、其他非传染性疾病和癌症检测上也会大放异彩。如今,中外CRISPR诊断技术公司进展不相伯仲,商业化和产业化也处于不断探索之中,未来的家用分子检测市场,谁主沉浮,大可期待!


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