近十年间，基因治疗蓬勃发展，FDA已经先后批准了3款以腺相关病毒（AAV）为载体的基因治疗产品，标志着疾病治疗开始迈入基因治疗时代。
以AAV为载体的基因疗法在许多单基因疾病中显示出实质性的疾病疗效，甚至完全治愈疾病的潜力，成为基因治疗的主流选择，然而也存在自身的局限性和一定的安全性风险。如何克服患者的预存免疫、重复给药的免疫反应、增强AAV载体组织靶向性和安全性等是AAV载体治疗领域的主要挑战。同时，优化基因治疗载体设计对于基因治疗企业实现差异化优势也是非常重要的。本研究中我们将对AAV载体面临的挑战及可能的解决方案进行分析梳理，并通过相关海外公司的案例，探讨新一代AAV载体创新发展之路。
20世纪70年代，科学家们就提出了基因治疗的概念。狭义的基因治疗是指将外源正常基因导入到靶细胞内，校正或置换致病基因的一种疗法。但苦于无法将基因片段或者基因编辑工具在体内有效传递，早年的基因治疗发展一直比较缓慢。
直到科学家们意识到病毒似乎可以肩负起这项使命，因为它们能够将自身的遗传物质引入到宿主细胞内，并利用宿主的“细胞工厂”持续表达，是非常天然的载体。于是，基因治疗迎来了从概念走向现实的关键性突破。
病毒载体的基因治疗是对病毒进行改造（比如删去复制基因）去除其引发传染性疾病的能力，再将目的基因通过质粒共培养的方式装载到病毒颗粒中，病毒感染细胞进入细胞核后释放目的基因并转录表达。
基因治疗的病毒载体转导过程（资料来源：北京瑞希罕见病基因治疗技术研究所官网）
病毒载体利用了病毒对细胞的天然嗜性，往往是受体介导的“侵染”过程，因此具有转导效率高的特点。目前大多数基因治疗应用的仍是病毒载体，经过改造后的病毒载体已经不具有原病毒的致病性。广泛应用的病毒载体包括腺病毒载体（ADV）、慢病毒载体（LV）、单纯疱疹病毒载体（HSV）、痘病毒载体（PV）及腺相关病毒载体（AAV）。腺相关病毒本身就是一种不致病的病毒，因此更加安全，AAV载体是临床试验中使用最多的病毒载体之一。
AAV是最具潜力和开发前景的病毒载体之一，属于微小病毒家族。AAV主要由两部分组成：蛋白衣壳（capsid）和包裹在衣壳内的遗传物质（长度为4.7kb的线性单链DNA）。许多哺乳动物包括人体内都能分离到各种血清型的AAV病毒，尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。
图：AAV立体结构图
AAV基因组包括两个T型的末端反向重复序列（ITRs）作为病毒复制的起点和包装信号；复制（rep）基因编码病毒复制所需的蛋白质，存在插入人类基因组的可能性；衣壳蛋白（cap）基因编码病毒的衣壳蛋白。科学家通过改造AAV，获得了用于基因疗法的优良载体—重组腺相关病毒（rAAV）。rAAV携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，取而代之的是治疗性转基因（transgene）。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。现在，AAV基因组中被保留的部分主要是编码衣壳蛋白的cap基因，以及ITRs。
图：野生型&重组型AAV基因组结构
作为基因递送载体，AAV颗粒与靶细胞表面的糖化受体结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。在内吞形成的内涵体（endosome）酸化后，病毒衣壳构象发生变化，使得病毒可从内涵体脱离，并通过核孔进入细胞核，或是经泛素化途径被降解。进入细胞核的AAV颗粒释放搭载的目标基因，目标基因在核内酶的作用下形成完整双链，转录、翻译可得蛋白产物。
rAAV转导示意图（资料来源：Schultz,Brian R.&Chamberlain, Jeffrey S.,2008）
从腺相关病毒1965年伴随一次腺病毒实验中偶然发现，到1984年第一个用于基因递送的腺相关病毒载体诞生，再到2017年第一个FDA批准基于腺相关病毒的基因治疗药物。AAVs相关研究已经持续近60年之久。
图：AAV发展历程（资料来源：点石整理）
从ClinicalTrails.gov上注册的基因治疗临床试验数量来看，以AAV为载体的基因治疗临床试验从2019年9月的190个增长到2021年7月的256个，明显可见AAV目前的热度。靶器官为肝脏的静脉注射基因疗法用于治疗代谢和血液病、帕金森病、A型和B型血友病是目前国际临床研究在研最热的3个主要适应症。
目前，三款以rAAV为载体的基因治疗药物已获批上市。
图：目前已上市的AAV基因治疗药物（资料来源：点石整理）
2021年9月AbbVie与Regenxbio就慢性视网膜疾病基因治疗候选药物RGX-314达成交易，交易总额超15亿美元，更是让AAV备受关注。据披露信息，AbbVie将向Regenxbio预付3.7亿美元，并承诺后续里程碑付款总额将高达14亿美元。
目前国内的AAV企业产品战略也是跟随美国已上市的方向，主要有两类，一类是罕见病；由于AAV的全身用药的安全性依然不明朗，眼科疾病作为局部用药相对比较封闭，另一类企业就选择眼科适应症。
国内企业目前AAV项目主要立足于国外已获批或国外进度较前产品的me-too或me-better，仍以罕见病为主，同质化程度较高。
资本市场更关注具有差异化优势的企业，行业发展的重点已转向新一代AAV改造。
AAV能够作为基因治疗中的明星载体，因为其拥有其他病毒载体无法比拟的优点：
1、安全性高：相对于其他种类的病毒，即使是未经改造的野生型AAV也未曾发现对人有致病性。AAV本身就是一种复制缺陷型的病毒，野生型AAV不能自我复制。
2、免疫原性低：AAV免疫原性显著低于腺病毒或慢病毒，在动物中多数情况下不会引起全身性免疫应答。
3、多种血清型：不同AAV血清型指病毒具有不同的衣壳蛋白，AAV进入细胞的过程依赖于细胞表面糖基化受体识别AAV衣壳蛋白，因此AAV衣壳蛋白决定了其组织靶向的特异性。目前文献中已存在数千突变型血清，具有极广的可选择性。临床常用的有AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8和AAV9等。
表：常见的AAV血清型的组织亲和性（资料来源：Genecreat公司官网）
4、表达时效长，感染效率高：长时程基因表达，治疗效果持久，甚至可以治愈。AAV目前在动物身上的实验表明，一次注射后其效果可以维持数年。
虽然AAV作为基因治疗中的明星载体，拥有其他病毒载体无法比拟的优点，但临床中仍存在较多局限性。
1、免疫原性和组织靶向性进一步提升
免疫原性和组织靶向性都取决于AAV亚型或血清型。由于迄今为止仅有十几种AAV血清型得到了很好的描述，还有很多血清型的特性没有被很好的表征，新的AAV衣壳生成已经成为基因治疗临床前开发的关键。
2、AAV基因递送中免疫屏障问题
血脑屏障是保护中枢神经系统的一道重要屏障，但它也阻隔了药物的传递和吸收，使神经系统疾病的治疗变得异常困难。因此，迫切需要有效突破血脑屏障的药物递送策略。
3、可携带基因的限制
AAV是单链DNA病毒，基因组结构简单，全长约4.7kb。与目前依旧热门的基因治疗载体例如腺病毒（外源基因容量~37kb），逆转录病毒（外源基因容量<8kb）或者慢病毒（外源基因容量<5kb）相比，AAV的基因递送容量实在是太小。
4、大规模的病毒载体制造、高昂的生产成本
AAV载体生产成本的控制较为关键。AAV细胞与基因治疗产品价格高昂的主要原因在于其工业化生产的多个方面未得到全面优化，如何降低成本、扩大商业化生产能力是AAV基因治疗产业化的最大难题。
针对AAV在临床中面临的免疫原性、组织靶向性、免疫屏障、可携带基因限制等挑战，科学家们探索不同的AAV改造方向。
不同的AAV血清型具有不同的组织侵染嗜性，为科研和临床应用提供了多样性的选择。然而，天然AAV通常特异性不够，并且机体对于天然AAV存在先天免疫甚至抗体，这将影响基因治疗的结果。因此，需要通过改造病毒衣壳蛋白，以便逃逸免疫系统且提高组织靶向性，开发新的AAV血清型对于大多数基于AAV的基因治疗至关重要。
随着早期AAV载体的知识产权保护已到期或即将到期，新型AAV衣壳为早期基因治疗公司提供了具有战略意义的知识产权保护，并有助于实现公司的差异化优势。
图：AAV载体特性和专利（资料来源：点石整理）
除了自然发现的AAV，设计AAV衣壳的主要技术有三种：理性设计、定向进化、计算机辅助设计。
图：AAV衣壳设计技术（来源：Nature Reviews Drug Discovery）
1、天然发现：
目前被广泛使用的AAV2是在被污染的细胞中发现的，而其他亚型的AAV几乎都是自然界中筛选出来的，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9都可以在人体中发现。
2、理性设计（Rational design）：
理性设计是改良病毒载体衣壳的首选策略之一，第一种方法是将特定多肽序列嫁接在衣壳表面，让它们可以与特定细胞表面的受体相结合。另一种方法是扰乱细胞对衣壳蛋白的降解过程。定点突变表面暴露的酪氨酸残基，通过抑制蛋白酶体降解和促进细胞内转运，促进靶细胞转导。
3、定向进化（Directed evolution）：
定向计划是模拟自然进化的机制，在衣壳蛋白中引入大量随机突变，然后在选择压力下筛选出具有特定生物性质和特征的衣壳。另外，在离散区域或整个cap基因上的易错聚合酶链反应（error-prone PCR）也是筛查生成衣壳库的一种可行方法。
4、计算机模拟设计（Computational design）：
生物信息学和计算机工具可以通过比较不同AAV的衣壳蛋白序列，推断出衣壳蛋白的进化过程，并且发现衣壳蛋白上具备高度多样性的区域。结合高通量测序，可以使用生物信息工具来设计衣壳变异库，以确定允许操作的高变异性区域。
除了开发新的血清型来提升AAV的组织特异性以及基因整体表达效率外，优化AAV的基因表达载体也是一个很好的备选方案。利用新的合成启动子/增强子，可以提高AAV介导基因表达的高效性以及组织特异性。
启动子是启动和控制相关基因转录的顺式作用元件，它是AAV表达载体上的一个关键元件。它们可以在转录起始位点上激活或抑制由RNA聚合酶II所介导的转录起始。目前外源性（通常来自病毒并具有组成型活性）或内源性（通常具有组织/细胞特异性）启动子已经被普遍用于AAV基因治疗载体。
内源性启动子往往是来源于仅在某些细胞类型中表达的基因，它们为基因治疗提供了组织特异性表达的可能性，然而这些启动子的表达水平通常低于组成型启动子。为了规避内源性启动子的固有弱点，许多不同的启动子优化策略已经被设计出来。比如在内源性启动子的上游添加增强子元件，这样既可以提高目标基因的表达水平，又保持其在组织上的特异性。除了增强子，其他顺式调节元件也可以添加到表达盒中以实现精细调节并提高转基因表达效率的目的。
图：典型AAV表达载体的组成部分（资料来源：Next-generation AAV vectors—do not judge a virus(only) by its cover）
AAV启动子优化中的主要挑战是确定启动子、增强子和非翻译区域中的哪些元件决定了基因表达的强度和/或特异性。幸运的是，一些高通量方法，已经被开发出来并被用于去鉴定、识别哺乳动物启动子、增强子活性。
1、使用二元AAV载体系统
在二元AAV载体系统中，外源基因被分割成两段并被包装到不同的AAV颗粒中。通过对同一细胞的共转化，外源基因片段可以在目标细胞内重新组装、转录以及表达。在理想情况下，二元AAV载体系统可以将外源基因承载容量扩充到9kb。
2、内含肽介导的蛋白剪接
内含肽是在多种生物中发现的自动处理蛋白域，这些蛋白能进行蛋白剪接，这是一个多步骤的生化反应，包括肽键的裂解和形成。与RNA剪接类似，内含肽将两个携带内含肽的蛋白部分衔接在一起，然后切除内含肽本身，从而形成完整的蛋白。
实验结果表明，通过内含肽的剪接作用，可以成功地将多AAV载体递送多肽片段拼接成完整且具有功能的蛋白质。
图：内含肽作用示意图（资料来源：药明康德）
整体来看，AAV载体面临的临床挑战及可能的解决和发展方向如下：
表：AAV载体基因治疗临床痛点和解决方案（来源：点石整理）
国外已有不少公司对AAV载体进行改造，从根据特定管线改造AAV到建立系统化改造平台，大药企寻找下一代AAV改造平台型公司进行合作。下面选取了一些具有代表性的海外AAV改造平台型公司，希望能够给国内企业的发展一些启示。
4DMT成立于2013年，是基于定向进化技术，在AAV基因药物载体开发领域处于临床领先地位的公司。
4DMT利用“演化和自然选择”的原则，推进和优化靶向AAV载体技术领域，并考虑到临床最佳给药途径、可控剂量和之前存在抗体的耐药性，创建出能有效靶向患者器官内特定细胞的载体。4DMT的“治疗载体演化”平台能够从超过37种独特且专有的4DMT AAV文库中部署超过10亿种独特的AAV变体，具有广泛的多样性。4DMT会应用公司专有方法从AAV库中找到领先载体，并产生出一种定制，新颖且专有的医药级产品。
目前公司管线覆盖眼科、心脏病学和肺科学领域，每个候选产品都利用了载体演化平台发明的有针对性的进化载体。眼科管线目前已进入临床1期。
图：4DMT管线情况（来源：4DMT公司官网）
公司于2020年12月在纳斯达克上市，历史投资人包括Viking Global Investors,Casdin Capital,Octagon Investments,Perceptive Advisors,Pfizer Venture Investments等。
Affinia 成立于2019年，由哈佛医学院副教授Luk Vandenberghe、加州大学旧金山分校副教授Aaron Tward和巴塞尔大学科学与医学系教授Botond Roska共同创建，这三位科学家在基因治疗领域一共撰写了200 多篇论文，申请了20 多项专利。
Affinia拥有AAV载体文库—“AAV Smart Libraries”，该文库包含了数千个功能性的新型AAV载体，每一个载体都是唯一识别的。该文库可在不同的物种中筛选出感兴趣的参数，包括组织适应性、制造产量和预先存在的免疫力。Affinia预计在未来几年内为每个主要组织开发一两个下一代衣壳载体。
ART平台包含三大支柱：
图：载体改造ART平台（来源：招股说明书）
目前主要的候选药物AFTX-001正在开发用于治疗异染性脑白质营养不良（NNO），第二个候选药物AFTX-002正在开发中，用于治疗继发于HER2+乳腺癌的脑转移。Affinia 预计将在2023年对这两个候选药物提交IND申请。同时，Affinia和罕见病基因疗法公司Vertex Pharmaceuticals建立了战略合作关系，Affinia通过公司专有的载体文库及其相关技术设计新型AAV衣壳，用于Vertex的遗传治疗工作，这次合作可以为Affinia带来47亿美元的净收入。
图：Affinia管线情况（来源：Affinia公司官网）
Affinia于2021年5月完成1.1亿美金B轮融资，投资方包括EcoR1 Capital，Farallon Capital Mgt.,RA capital，Google Ventures等。2022年1月，公司已向美国证券交易委员会提交上市申请，计划在纳斯达克上市，拟募资1亿美元。
Dyno Therapeutics成立于2018年，由哈佛大学医学院George Church及其团队与瑞典卡罗林斯卡医学院（Karolinska Institute）和瑞典隆德大学（Lund University）的原始研究人员成立。公司利用人工智能（AI）设计新一代AAV载体，使基因疗法更加安全有效，基因药物工业化制备成本更低。
Dyno的CapsidMap平台代表了一种应用AI和wet lab方法来构建新型AAV衣壳的变革性方法，旨在优化AAV衣壳的组织靶向性和免疫逃逸能力，以及提高包装能力和容易生产的特点。与传统方法不同，CapsidMap特别适合同时优化衣壳，以进行跨多个器官的递送，为多种疾病提供更为有效的全身治疗。Dyno Therapeutics — CapsidMapTM平台通过机器学习方法对系统化、快速优化AAV衣壳，提高靶向能力和有效负荷，克服免疫逃逸和生产制造的局限。
图：Dyno CapsidMap平台（来源：Dyno公司官网）
公司于2020年与诺华，Sarepta达成高达20亿美元的合作，共同基于其AI平台CapsidMap，开发治疗眼部疾病和肌肉疾病的新型疗法。与罗氏及旗下Spark Therapeutics达成了18亿美元协议，开发CNS和肝脏疾病新型疗法。2021年，与安泰斯来达成合作以治疗骨骼肌和心肌疾病。
公司于2021年5月完成1亿美元A轮融资，由Andreessen Horowitz领投，Casdin Capital，GV，Obvious Ventures，Lux Capital以及创始投资者Polaris Partners，CRV和KdT Ventures跟投。
SpiceBio成立于2012年，针对AAV装载能力有限之这一挑战，SpliceBio建立蛋白剪接平台，使利用AAV载体高效递送大基因成为可能。这种新方法利用工程化的内含肽，催化高效的蛋白剪接，在体内重建所需的全长治疗性蛋白。该平台是基于普林斯顿大学（Princeton University）科学家20多年对内含肽（intein）和蛋白质工程学的开拓性研究，确定了内含肽结构与活性之间的关系，并且优化了它们的特征，用于疗法开发。
目前主要适应症为Stargardt病，Stargardt病是青少年黄斑营养不良最常见的形式。该病是由于ABCA4基因的功能缺失突变引起的，而ABCA4基因长达6.8kb，对单个AAV载体来说太大。蛋白剪接技术可以将原本无法包装进一个AAV载体的ABCA4基因分成两部分，分别表达携带内含肽的部分蛋白，然后内含肽在细胞内介导蛋白剪接，合成具有功能的全长蛋白，从而克服AAV载体载荷有限的障碍。除了在Stargardt病和其他眼科适应症外，公司还在其他几个治疗领域开发基因治疗项目，该平台也得到了验证。
公司于2022年2月完成5000万欧元A++轮融资，由UCB Ventures和现有股东Ysios Capital共同领投，新投资者New Enterprise Associates(NEA)，Gilde Healthcare，诺华风险基金等跟投。
尽管最近AAV临床试验波折众多，但机遇和挑战并存，新的发展方向依然受到产业及投资重点关注，行业发展的重点已转向新一代AAV改造。
Dyno Therapeutics，Affinia Therapeutics，4DMT，StrideBio等公司都已参与下一代AAV衣壳平台相关靶点的合作；SpliceBio通过蛋白剪接技术提升AAV载装载能力；寻求下一代AAV衣壳技术的合作伙伴包括Sarepta、罗氏/Spark、诺华/Avexis、武田和CRISPR Therapeutics等。
部分国内企业同样在AAV改造上提早布局，比如信念医药建立了先进的AAV衣壳改造平台，BI和克睿基因合作开发新型AAV载体，纽福斯与AAVnerGene就新一代眼科基因治疗AAV载体技术建立全球战略合作伙伴关系，派真与华深智药合作利用高性能分布式计算和人工智能（AI）技术的数据迭代加速新型腺相关病毒（AAV）衣壳开发等。
从目前国内外的研发趋势看，我们有理由相信AAV载体仍是当下基因治疗应用的最优解，而新一代工程化AAV载体也将驱动基因治疗下一场革命，获得更广泛的应用。
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