从古至今，人类对微观世界的探索从未止步。不论是面包上野蛮生长的霉菌，还是血液里不停滚动的红细胞，都激起人们强烈的好奇。为了满足这一探索的欲望，显微镜应运而生。
随着对微观生物体研究需求的深入，常规光学显微镜分辨局限于波长和孔径，无法清晰地分辨其内部超微结构。20世纪末期，具有划时代意义的激光共聚焦显微镜出现了。
图 常规光学显微镜
在某一期《非诚勿扰》上，一个男嘉宾提到“你透过我的瞳孔衍射在我的视网膜上留下一道艾里斑”。而激光共聚焦显微镜之所以能够大幅提高分辨率，就是在艾里斑下了功夫。
图 普通宽场显微镜(A)和激光共聚焦显微镜(B)的成像对比
艾里斑(Airy Disk)是点光源由于衍射而在焦点处形成的光斑。中央是明亮的圆斑，周围有一圈圈较弱的明暗相间的同心环，就如同涟漪一般。我们看到的图像，其实是无数艾里斑叠加产生的。
图 艾里斑
普通宽场显微镜收集了所有的光斑信号，包括周围较弱的环斑，会互相干扰，因此成像就比较模糊。而共聚焦显微镜巧妙地在光路中加入了针孔，选择性地接收光斑中心焦平面信号最强的部分，由此提高了成像质量，分辨率更高。
图 普通宽场显微镜和激光共聚焦显微镜的成像原理
有了激光共聚焦显微镜这一有力武器，科学家们对微生物和细胞的培养和观察更加精准。为了筛选或识别出感兴趣的目标，各种表型识别技术应运而生。
1.1 荧光成像技术
荧光就是在特定波长的激发下，可以显示出各种波长的光（颜色）。除了观察样品的固有自发荧光之外，可以利用荧光探针、特异性抗体染色，或者通过基因重组表达荧光蛋白。通过荧光显微镜观察细胞是非常常见的研究方式，可以进行特定蛋白、细胞器等在组织及细胞中分布、相互作用的观察。
图 荧光蛋白
荧光显微镜通常是利用高压汞灯作光源，除了通过目镜观察形态外，还利用可以检测微弱荧光的高灵敏度CCD照相机捕捉光信号，实现高质量成像。
在大部分情况下，荧光光谱中一个荧光物质对应一个峰。不难发现，各个荧光光谱之间会发生重叠，且不能负载过多种类的荧光，否则会互相干扰。同时，如果通过荧光显微镜观察微生物时，还需要面对前处理、自体荧光干扰、摸索荧光标记物的作用靶点、光漂白、光毒性等问题。因此，在复杂组分微生物和细胞的识别和筛选中，荧光成像难以提供详尽的信息。
1.2 拉曼成像技术
拉曼光谱，或者说拉曼散射（Raman scattering），是由印度科学家Chandrasekhara Raman利用太阳光观测发现的，并获得了1930年度的诺贝尔物理学奖。他发现，当光穿过透明介质，部分被散射的光发生频率改变。
具体而言就是，绝大多数光子打到一个分子上，会发生弹性碰撞，波长和频率都没有变化，称为瑞利散射（Rayleigh scattering）。而有一小部分的光子，其能量被分子的各个化学键吸收了，实现能量交换，光的波长和频率就发生了变化。变化的规律和分子结构、形态、结晶度息息相关，这一现象被称之为拉曼散射，以此组成了拉曼光谱，又可以称为“分子指纹”。如果能精准地捕捉到拉曼散射，就能实现物质的识别。
拉曼光谱反应的是分子最真实的状态，因此不需要对样品进行预处理，实现了真正的无损、原位、实时和精准检测。在生命科学、生物医药等领域，拉曼都是研究的热点。
细菌、微生物鉴定是一个生物发酵行业最为核心的研究内容，传统的细菌分类法使用最多的是通过菌落的形态和生理生化反应结果对细菌进行鉴定，如细菌培养法、生化鉴定等方法。这些方法费时费力，操作复杂而且易出错，难以分离相似的菌种。新兴的分子生物学实验如PCR，则对样品纯度和浓度要求较高，操作难度更大，成本高，也难以区分基因型相似的菌株。而上述的问题限制了生物发酵行业的发展，最大的痛点就是无法找到有效的菌株，面对铺满培养皿、形态各异的菌群，就如同大海捞针。
拉曼光谱作为一种快速无损的鉴定手段，无需扩培或者主观分析形态，就可以分析单个细菌和微生物，在物种和菌株水平上进行分类，筛选新型、高效菌种。
图 不同菌株的拉曼光谱
1.3 红外光谱技术
除了拉曼光谱，还有一类振动光谱叫做红外光谱（Infrared spectrometry）。分子吸收某些波长的红外线后，分子振动能级跃迁 (同时伴随转动能级跃迁)，分子偶极矩变化是红外光谱产生的原因。红外光谱是能够定量进行成分鉴定的分析方法。
（2）红外更易检测，信号更强。拉曼信号更弱，但是没有重叠谱带；
（3）拉曼可以检测水溶液（水的拉曼散射很弱），红外不适用于水溶液样品的测定；
（4）检测拉曼光谱不需要提前处理样品，红外样品检测需要预处理；
（5）拉曼谱图提供的信息更全面，除了吸收频率、强度、峰形（这三要素红外光谱会提供），还有去偏振度；
（6）拉曼光谱能够在玻璃仪器中检测，而红外光谱不能。
拉曼和红外光谱都能够反映分子结构信息，两者是互补的特性。然而拉曼散射光极其微弱，因为当光照射到样品上时，仅有千万分之一的概率会发生拉曼散射。如同在案发现场需要小心翼翼地采集指纹，作为“分子指纹”的拉曼光谱，在采集上也颇有难度，一有偏差，就会发生“冤假错案”。因此在很长一段时间里这项技术陷入瓶颈期，更易检测的红外光谱顺势发展。而随着激光器的问世，能够提供更多精准信息的拉曼光谱得到重视，开始广泛应用于各个领域。
拉曼成像设备需要搭配极其优异的光学组件和多维矫正设备，开发技术壁垒高。拉曼共聚焦显微镜品牌主要有Thermo Scientific、HORIBA、Oxford Instrument WITec等老牌厂商。
图 Thermo Scientific DXR3xi 拉曼成像显微镜
图 HORIBA XploRA INV多功能拉曼及成像光谱仪
图 Oxford Instrument WITec alpha300 R拉曼成像显微镜
反观国内市场，共聚焦拉曼显微镜等高端光学仪器仍由进口厂商主导，国产替代亟需加速。高校、研究所，是孕育新兴技术的沃土，光学也不例外。以长春光机所、西安光机所为首的中国光学领域研究所，要实现关键核心器件的自主可控，关键核心器件是高端光电仪器的重要攻关方向，未来才能够打破现在“卡脖子”的局面，为国产光学仪器争取一席之地。
中国科学院长春光学精密机械与物理研究所（简称“长春光机所”）始建于1952年，由中科院长春光机所与中科院长春物理所于1999年整合而成，是新中国在光学领域建立的第一个研究所，主要从事发光学、应用光学、光学工程、精密机械与仪器的研发生产，被誉为中国光学的摇篮。
建所70年来，长春光机所在以王大珩院士、徐叙瑢院士等为代表的一批科学家的带领下，创造了十几项“中国第一”；组建、援建了10余家科研机构、大专院校和企业单位，并为其输送了2200多名各类专业人才；有27位在本所学习或者工作过的优秀科学家当选为两院院士，并涌现出“知识分子的优秀代表”蒋筑英等众多英模人物；先后参加了“两弹一星”、“载人航天工程”等多项国家重大工程项目，为我国国防建设、经济发展和社会进步做出了突出贡献。
中国科学院西安光学精密机械研究所（简称“西安光机所”）创建于1962年，是中国科学院在西北地区最大的研究所之一。研究所科研体系设有四大研究部，分别是基础科研部、光电技术部、空天技术部、先进制造部，下设26个研究单元，科研体系包括一个国家重点实验室、三个中科院重点实验室、两个陕西省工程技术中心、一个陕西省重点实验室，依托相应研究单元建设运行。并拥有完整的技术支撑体系。
现有在职人员955人，高级科研人员400人，其中正高128人、中国科学院院士1人，国务院特殊津贴专家16人，各类国家级人才12人。龚祖同学部委员（院士）、侯洵院士、薛鸣球院士、牛憨笨院士、相里斌院士均出自西安光机所。
6. Advanced fluorescence microscopy techniques—FRAP, flip, flap, FRET and flim
7. Raman Investigation of Microorganisms on a Single Cell Level
10. Thermo Fisher Scientific 官网
