行研 | 微流控技术进入发展快车道,加速快速检测落地和升级

前言

IVD整体趋势向方便,智能化,价格低,准确性提高的方向发展,大厂商适合做集成和流水线,初创公司适合在POCT方向发力。微流控可以应用于生化、免疫、核酸、细胞等诊断技术,目前生化、免疫已经进入全自动、成本快速下降的阶段。同比之下,分子诊断仍然处于自动化程度低、产品价格昂贵的阶段。微流控芯片因集成化、小型化、自动化,替代流水线式分子诊断的前景良好,适合用于核酸和细胞检查,也有切入免疫市场,做特色项目的空间。


1. 分子诊断市场概况

2019年我国IVD整体市场规模达713亿,CAGR 21.2%。其中分子诊断市场规模132亿元,占18.5%,CAGR 32%,IVD细分市场增速第一,目前主要应用于传染病等领域。传染病检测包括使用PCR,mNGS等手段检测细菌,病毒,寄生虫等。

 

对于目前的病原微生物检测市场,免疫占80%,分子诊断占20%,其中40%为PCR的方法。免疫学诊断是基于特定的生物标志物抗体和光学感应来检测相应的病原微生物,存在一些如微量无法检测、缺少信号、高背景噪声、重复样品与对照间结果不一致的问题。而分子诊断已进一步扩大到蛋白质组和基因组的方法,例如质谱法(MS),聚合酶链式反应(PCR),等温扩增,和高通量下一代测序(NGS)。

随着简便的提取技术的成熟,高通量、高效率核酸提取系统应用普及,PCR、LAMP等核酸检测方法在未来一段时间内将仍是临床诊断技术的主流。全自动一体化核酸检测技术快速发展,未来市场增速超过传统PCR。随着对步骤精简,检测时间,多联检和操作性的要求逐渐提高,便捷、高效的检测方式成为大势所趋。全自动一体化核酸检测技术拥有便携、及时、多靶点超联检、结果准确等特点,解决目前临床痛点。

以新冠病毒检测为例,全自动一体化PCR技术具有全封闭、时间快、通量大、成本低的优势,更适用于POCT感染场景。

全自动核酸检测一体机可覆盖现有感染分级体系下90%应用场景,在检验科外新兴场景(急诊、住院等)技术优势明显。

除了新冠病毒检测,POC设备还被各大厂家用于其他病原体检测,下表统计了部分知名的POC机器,种类,生产商,病原体和检测时间。

市场良性循环,大型诊断公司正在竞相收购。它们通常在庞大的产品组合中提出一些成功的微流控解决方案。包括雅培Abbott、美艾利尔、生物梅里埃bioMérieux和罗氏Roche在微流体解决方案的驱动下,至少在一个细分市场见证了增长。在众多开发微流控产品的公司中,最有前途的产品往往会被大型诊断公司收购,比如Alere,IQuum,BioFire,Cepheid和Nanosphere。同时,GenePOC还收到了来自Debiopharm的大量投资。
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2. 微流控技术

对疾病进行早期发现和监测,是优化治疗中降低死亡率和提高总体成本效益必不可少的。快速和更准确的诊断技术和工具是用于临床诊断目的的病原微生物(包括原核细菌,真核真菌,病毒,寄生虫,病毒和原生动物)鉴定中的关键问题。

微流控系统是一种自动操纵设备,包含允许液体流动的微通道(10–100μm),以及其他几个组件,包括微型泵,微型进水阀和微型化的出口排水装置,并结合了用于分析内容物的不同设备。微流控芯片已在病原微生物检测,识别食物中的微生物以及发现新的抗生素中被使用。微流控系统代表了新一代常规检测方法,该方法依赖于包括标本制备,试剂处理,生物反应和检测等步骤,这些步骤可以集成到一个独特的平台中,又被称作芯片实验室(lab on chip,LOC)。

(向下滑动阅读微流控的材料、工艺、分类、通道设计、设计原理)

1. 微流控的材料

在微流控芯片使用的材料中,聚合物材料应用广泛,可用于任何诊断技术,且价格相对较低。玻璃特别适用于需要高精度和多路复用的应用。纸质材料是新型的微流控芯片材料,价格便宜、使用方便,但基于细胞的检测不能在纸质系统上进行。

2. 微流控的工艺

传统微加工的基本技术包括光刻,湿法/干法蚀刻和添加法,所有这些技术都是从半导体工业中的微机电系统工艺技术发展而来的。常见的芯片制作工艺流程主要是:芯片设计→芯片加工(刻蚀与注塑)→封装(合)→表征检查(显微/电镜镜检)→产品化→量产。

其中加工与生产工艺有:光刻和刻蚀技术、热压法、模塑法、注塑法、LIGA法(集合光刻、电铸和塑铸)、激光烧蚀法、软光刻。

3.微流控的分类

微流控技术分类,目前学术界没有统一标准,通过阅读大量资料,分类方法有如下几种:

(1)根据微流控的驱动原理来分类:

1)自驱式微流控:利用表面亲疏水特性或毛细力来进行流体的输运与处理的方式。典型的如纤维基微流控芯片,包括纸基、布基、聚合物塑料基等材质的微流控芯片。其特点是自驱动、无需额外泵源和能源,可用于简单的流体驱动与控制。

压力式微流控:利用气体压力或液压或气液压混合,来控制液体在芯片中的运动。这种控制方式一般会通过微泵、微阀门的技术实现。微泵会用到抽吸,微阀会用到挤压(类似于耳膜效果),通常会结合压力传感器来精准控制。

2)离心式微流控:一般为对称盘式构型,利用旋转产生的离心力来驱动液体在芯片中的运动。

3)磁力式微流控:利用磁场来控制流体中的磁性物质,以驱动流体的运动。

以上三种是最为常见的控制方式,需要注意的是,三种控制方式往往并不是单独使用,而是为了实现功能,通常会联合使用不同的控制方式,来操控同一块芯片中的流体。

(2)根据检测对象来分类,分为血球微流控、流式微流控、血凝微流控、血气微流控、生化微流控、免疫微流控等。

(3)根据芯片使用材料来分类:

1) 无机硅/玻璃/石英芯片

2) 纸芯芯片

3) 金属芯片

4) 有机塑料芯片:高分子聚合物

  • PDMS芯片:聚二甲基硅氧烷
  • PMMA芯片:聚甲基丙烯酸甲酯
  • PC芯片:聚碳酸酯
  • PS芯片:聚苯乙烯
  • PE芯片:聚乙烯
  • ABS芯片:丙烯腈-丁二烯-苯乙烯

(4)其中,有机塑料芯片根据聚合的原理,还可分为:

1)热塑性聚合物:PMMA、PC和PE等

2)固化型聚合物:PDMS、环氧树脂和聚氨酯等,他们与固化剂混合后,经过一段时间的固化变硬即可得到芯片

3)溶剂挥发型聚合物:丙烯酸、橡胶和氟塑料等,制作时将他们溶于适当的溶剂,再通过缓慢挥发溶剂而得到芯片

(5)根据芯片硬度,可分为:硬质、软质。

 


4.微流控系统和芯片实验室中的微通道设计

用于开发微流控技术的大多数程序都利用了最初在半导体领域得到验证的概念,芯片实验室(LOC)平台与微阵列和生物传感器相似。用于病原体检测的微流控系统最重要的方面是微通道的设计,设备的制造,以及生物标志物,生物分子等的鉴定和定量。

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要在非常低的样本量的情况下实现这些目标,需要超高的灵敏度和特异性,而微流控等诊断系统可以实现。这些检测平台通常与其他设备组合在一起以进行数据采集,信号处理和监视。读数可以采用各种光学技术,磁阻传感器(GMR),电化学检测,声学方法,质谱方法(MS)或核磁共振(NMR)。


5.微流控的设计原理

(1)基于液滴的微流控

有几种技术可以将样本分装成液滴,将包括细胞在内的液滴加载到微流控通道中,并转移到芯片内的不同位置,然后进行一系列操作,例如细胞裂解,DNA提取和纯化,PCR和荧光检测。具有少量提取液的DNA液滴(几纳升)被不混溶的液体(例如矿物油)分离,形成乳液。然后通过加热该乳剂进行热循环,相机捕获随后的荧光。该平台通常用于单细胞研究,通常称为“单细胞PCR”,其拓展包括最近火热的单细胞测序,可用于包括植物学,肿瘤学,干细胞以及发育研究,神经学,血液和免疫系统,药物反应机制以及用药指导等方面的研究。

(2)基于微通道的微流控

通过在诸如硅,玻璃或聚合物(通常为聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯)的材料中进行微加工来制造各种芯片结构,形成不同的孔或微米级通道。将样品上样至孔或通道中,随后通过PCR扩增DNA。小型化的PCR系统可提供便携性并节省时间,总反应时间取决于一系列参数,例如芯片大小,PCR主混合物体积,底物的热导率和温度循环速率。

(3)基于虚拟腔室的微流控

将PCR主混合物分配到固定位置,例如疏水/疏油玻璃盖玻片,并用矿物油覆盖,使用甜甜圈形微型加热器在虚拟反应下进行热循环,利用被动冷却方法,形成虚拟反应室。

2.1 微流控的市场情况

传染病和癌症是微流控技术诊断的主要疾病。生物标志物,肿瘤细胞,病原体或病毒颗粒通常可在患者的循环血液中进入。随着测序技术的发展,微流控在基因疾病的检测上也逐渐开始发力。另外,发病率与日俱增的神经退行性疾病和糖尿病也是微流控技术的广阔市场。

用于诊断目的的微流控系统的优势是快速检测,易用性,成本效益以及在识别传染病方面的高精度。在医学中使用微流控芯片可显著缩短检测与临床治疗之间的时间间隔,这对于患者生存至关重要。便携式微流控试剂盒所提供的优势在医疗服务较差的地区尤其显著。

常规的病原微生物检测方法主要有免疫学检测法和分子生物学法等。其中传统的生化鉴定法、细菌培养等,简单、直观、费用低,能够准确获知样品中病原微生物特性,被认为是“金标准”。但上述法特异性低、周期长(5-7 天)、耗时费力,而且对培养环境和操作人员要求严格,不适宜病原微生物的快速诊断。

非典型病原体,如肺炎支原体,肺炎衣原体等通常采用血清抗体检测,或分子检测。病毒的检测则有所不同,传统的培养,血清学都难以跨越性能和检测种类的限制。对于病原体检测来说,传统的培养方法难以解决病毒的快速诊断问题。

免疫学检测方法利用抗原-抗体的识别和结合,较培养法更加特异和快速,是一种可以定性和定量的综合技术,常用方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光免疫分析法、免疫胶体金技术等,但免疫学检测也存在反应的“窗口期”,对病原微生物含量较少的样品往往需要富集的过程,增加了检测时间,在拥有高级医疗中心的大城市中,这是难以让人接受的,需要使用即时医疗(POC)技术来缩短此时间。

以微流控为核心的芯片实验室或微全分析系统为POCT提供了极为有利的技术平台。微流控系统的高性能,小尺寸和便携性,加上对芯片进行测量和光学监控的能力,使得优化诊断方法得以实现。一方面,微流控技术可以在微型化装置上实现复杂分析所涉及的多功能单元集成及操作自动化,从而避免传统复杂多步生物分析对专业实验室及操作人员的需求;另一方面,微尺度下反应/分析速度快、样品试剂消耗少、易于实现高通量分析。这些特性高度契合POCT的发展需求,因此微流控技术日趋成为构建POCT系统的核心技术。

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2.2 微流控的发展现状

随着技术发展,高通量的微流控产品作为下一代检测技术,既要保留常规POCT(快、小巧)和大型设备(性能优异、自动化程度高)的优点,同时也会解决常规POCT(性能差)和大型设备(体积大、硬件复杂、成本高昂)的缺点。

微流控技术的发展现状在技术原理上,已经完全打通。因为涉及的学科(微机电、材料学、光学等)较多,集成难度较大,各厂家的生产成本相对较高,单片芯片生产成本在20元以上的非常多,且部分厂家因为芯片结构设计复杂而存在量产的困难。通过不断技术改进和优化,成本也在稳步下降中,少数厂家的单片芯片批量生产成本可控制在5元以内,甚至更低。因为制造成本下降,多重PCR开始普及,海内外陆续有许多企业布局多联检,超联检。

另外,因为微观操控要求的精度高,在性能上整体与大型设备相比还是有一定差距,但也在不断缩小。现有的技术在寻找市场突破点方面,一般通过以下两个方式:

(1)常规手段还无法实现自动化检测,例如分子检测。常规的分子检测,需要采用多个设备,且分隔在不同的空间内,以防止交叉污染。使用全程封闭且集成一体化的分子微流控芯片,能实现Sample in,Result out的目标。

(2)价值较高的检测项目,因为价值较高,鉴于POCT的应用场景(快、小巧灵活),相对高成本的微流控产品还是有一定的市场空间,且允许生产厂家、代理商和终端客户保有一定的利润空间,而不至于亏损。

2.3 微流控相关国家政策


3.微流控全自动一体化PCR代表企业

赛沛是一家总部位于美国加州的分子诊断公司,致力于研发、生产、销售快速易用的分子诊断系统和试剂盒,于2016年被丹纳赫以40亿美元收购。赛沛通过将高度复杂且耗时的手工操作自动化,对微生物和遗传病进行复杂的基因检测。赛沛拥有强大的分子生物学平台GeneXpert系统,该系统采用模块化配置,具有很好的扩展性,能够同时执行1个到80个Xpert检测。因此,无论是床旁诊断,还是更多样本量的参考实验室,GeneXpert系统均能满足客户对工作量的要求,同时提供即时检测结果。GeneXpert系统运行专属的Xpert试剂盒。Xpert检测项目涵盖了医疗相关性感染、性健康、危重感染、肿瘤等应用领域。

生物梅里埃是一家总部位于法国的公司,以“在全世界对抗感染性疾病的事业中保持领先地位”为使命,不断加强在感染疾病诊断领域的领先地位;创建出新的微生物、免疫以及分子诊断学;增加研发项目并加强对国际发展的投资。产品FilmArray是经 FDA、CE-IVD 和 TGA 认证的多重 PCR 系统,该系统集样品制备、扩增、检测和分析功能于一体,可实现快速、简便、全面检测。手工操作2分钟,运行时间1小时,可检测呼吸道感染23项、血流感染43项、胃肠道感染22项,包含各种病原体靶标以及抗生素耐药基因。目前多联检大panel产品在国内尚未拿到注册证。

 

 

江苏汇先医药以国际领先的微流控技术为基础,研发出了一系列快速体外诊断试剂盒及全自动仪器。陆续推出了肿瘤早筛和用药指导、感染快速检测两条线的30多个产品,包括全自动核酸超联检系统、常见病原微生物核酸联检试剂盒、新冠快检试剂盒、循环肿瘤细胞快速检测系统、稀有细胞快速富集系统等。公司秉持国际一流的微流控、核酸检测、免疫检测等技术,与国际一线科研院所及国际国内顶级医院合作紧密,现有自主专利150多项。汇先医药的核心研发团队包括英国剑桥大学归国博士、教授、英国皇家科学院院士等,在上海和苏州分别建设有研发中心和医疗器械标准生产基地。